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本指導原則旨在指導注冊申請人對結直腸癌相關基因甲基化檢測試劑盒的臨床試驗開展及臨床試驗資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門提供參考。
本指導原則是對結直腸癌相關基因甲基化檢測試劑盒的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用。若不適用，需具體闡述理由并提供相應的科學依據，同時依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。
本指導原則是供注冊申請人和技術審評人員使用的指導性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。
本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，相關內容也將適時進行調整。
一、適用范圍
我國結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）的發病率和死亡率均保持上升趨勢。結直腸鏡檢查結合病理活檢作為結直腸癌確診的金標準，由于其檢查為有創檢查，存在一定的局限性，臨床患者依從性較低。通過檢測糞便或外周血樣本中相關基因甲基化水平輔助診斷結直腸癌具有一定的臨床使用價值，是對傳統診斷方法的有效補充。
本指導原則所述基因甲基化檢測試劑盒是指基于核酸聚合酶鏈式反應（PCR法）或其他分子生物學方法，用于體外定性檢測人糞便或血漿樣本中的人基因甲基化的體外診斷試劑，臨床用于結直腸癌的輔助診斷。適用人群僅限于臨床醫生建議進行結腸鏡檢查，但因病人依從性差或其他醫學原因不適合接受結腸鏡檢查的患者，該檢查不能單獨作為結直腸癌確診的依據。本指導原則不適用于結直腸癌篩查用途的產品。
對于其他被測物、其他樣本類型適用于相同預期用途的產品，可根據產品特點考慮本指導原則的適用性，并參考執行。
二、注冊審查要點
（一）臨床評價資料
1.臨床評價路徑和基本要求
該類產品應通過臨床試驗路徑進行臨床評價，臨床試驗的開展應符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》《醫療器械臨床試驗質量管理規范》以及《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的相關要求，如相關法規、規章、規范性文件有更新，臨床試驗應符合更新后的要求。
2.臨床試驗開展應具備的基礎
臨床試驗開展應建立在充分的非臨床研究基礎之上，包括科學的產品設計、充分的分析性能研究、陽性判斷值研究等。并在此基礎上確定明確的產品預期用途，包括適用場景和適用人群。
針對多項標志物聯合檢測產品，應提供標志物選擇的依據，確認分析標志物組合的合理性。
3.臨床試驗設計和實施的要求
臨床試驗應選擇不少于3家（含3家）符合要求的臨床試驗機構開展。
臨床試驗應按照產品說明書的要求采集樣本、評價樣本質量、完成樣本處理、檢測和結果解讀。試驗中按要求進行相應的設盲操作，試驗全過程注意避免引入偏倚。臨床試驗產生的所有信息應進行詳實的記錄。
臨床試驗建議從以下三個方面對產品臨床性能進行評價。
3.1結直腸癌輔助診斷臨床性能的評價
3.1.1試驗方法
建議采用試驗體外診斷試劑與結直腸癌診斷的臨床參考標準進行比較研究，評價試驗體外診斷試劑對于結直腸癌輔助診斷的臨床靈敏度、臨床特異度等指標。按照結直腸癌診療指南和診療規范的相關要求，臨床參考標準建議采用結腸鏡檢查和/或組織病理學檢查。
3.1.2入組標準
入組受試者應為臨床醫生建議進行結腸內鏡檢查的結直腸癌或結直腸癌前病變疑似病例。入組受試人群應包括結直腸癌不同分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期）患者、結直腸進展期腺瘤患者、腸道良性疾病患者（腸息肉、腸腺瘤、腸炎、腸黑變病等）及其他適用人群。
為了對產品臨床特異度進行充分評價，還應納入其他消化系統腫瘤患者包括胃癌、肝癌、食管癌、其他消化系統腫瘤（膽管癌、胰腺癌等）等。對于血漿樣本檢測試劑還應納入常見非消化系統腫瘤患者包括肺癌、乳腺癌、宮頸癌、甲狀腺癌等。其他腫瘤患者病例應具有影像學可評價的腫瘤，各種腫瘤疾病患者的診斷依據相關疾病診療規范執行。
3.1.3樣本量
可采用單組目標值法公式估算最低樣本量：
公式中，n為樣本量；Z1-α/2、Z1-β為顯著性水平和把握度的標準正態分布的分數位，P0為評價指標的臨床可接受標準，PT為試驗體外診斷試劑評價指標預期值。
評價指標包括臨床靈敏度、臨床特異度以及各亞組的臨床靈敏度、臨床特異度。應分別估算結直腸癌患者例數、干擾組病例數（包括腸道良性疾病患者、其他癌癥患者等）以及腸道無顯著發現例數。根據已有文獻數據，經統計學估算，建議結直腸癌病例不少于200例，其中各分期病例均應有一定例數，建議Ⅰ期不少于80例，Ⅱ期不少于50例；進展期腺瘤不少于200例；胃癌、肝癌、食管癌建議分別不少于30例，其他各種消化道癌癥亦均應有病例入組且總例數建議不少于30例；針對血漿樣本類型，非消化系統各種癌癥病例建議每種不少于30例。
3.1.4臨床評價指標和統計學分析
一般采用四格表方式對臨床試驗結果進行總結，計算靈敏度、特異度并計算95%置信區間。同時應針對結直腸癌不同分期、以及進展期腺瘤患者分別計算臨床靈敏度；針對不同類型腸道良性疾病患者、其他不同癌種病例以及腸道無顯著發現患者分別分析臨床特異度。
依據臨床需求和已報道研究數據，部分關鍵亞組臨床性能評價指標推薦的最低可接受標準（95%置信區間下限）見表1, 針對血漿樣本類型，應設置科學合理的最低可接受標準。
表1糞便樣本類型產品亞組臨床評價指標推薦最低可接受標準
亞組 | 評價指標 | 預期可接受標準 |
結直腸癌 | 臨床靈敏度 | 80% |
進展期腺瘤 | 臨床靈敏度 | 40% |
其他腺瘤 | 臨床特異度 | 80% |
其他惡性腫瘤 | 臨床特異度 | 80% |
腸道無顯著發現 | 臨床特異度 | 90% |
對于檢測結果與臨床診斷結論不一致的樣本，應結合患者疾病背景信息、其他臨床實驗室檢驗結果等對差異原因進行合理分析。
3.2基因甲基化檢測性能的評價
3.2.1試驗方法
針對所有被測基因，建議采用試驗體外診斷試劑與已上市同類產品或實驗室參考方法進行對比試驗。基因甲基化檢測實驗室參考方法可以為Sanger測序法、NGS、數字PCR等。實驗室方法應進行充分的性能驗證，包括最低檢出限、準確度、精密度等，確認與試驗體外診斷試劑具有良好的可比性。同時提供詳細的方法建立和性能驗證資料。如對比方法檢測試驗委托第三方實驗室或檢測機構完成，應提供臨床試驗機構委托該試驗的委托協議。
當試驗體外診斷試劑包含多項被測物時，原則上應針對所有標志物分別進行檢測性能評價。如不適用，應提供充分的理由和依據，并采用合理的方法進行檢測性能評價。
3.2.2入組標準
入組受試者應為臨床醫生建議進行結腸內鏡檢查的結直腸癌或結直腸癌前病變疑似病例。
3.2.3 樣本量
應針對所有基因（如適用）分別估算陽性樣本量和陰性樣本量，建議采用單組目標值法公式，目標值（P0）設定應有合理依據，基因甲基化檢測陽性符合率、陰性符合率目標值建議不低于90%。
3.2.4 臨床評價指標和統計學分析
采用四格表方式對臨床試驗結果進行總結，計算陽性符合率、陰性符合率和總符合率，并計算95%置信區間。
如為多項基因甲基化聯合檢測，應針對不同基因甲基化分別估算樣本量，并分別進行統計分析。
對于檢測結果不一致的樣本，建議結合患者疾病背景信息、其他臨床實驗室檢驗結果等對差異原因進行合理分析。
3.3手術前后基因甲基化檢測評價
對于尚無同類產品上市的產品，開展臨床試驗時建議入組一定數量罹患結直腸癌或癌前病變、且治療前本產品檢測為陽性的患者，收集其手術前后的樣本，采用試驗用體外診斷試劑進行檢測，評價術后陰轉百分比（參表2）。對于未見陰轉的病例，應結合患者疾病治療效果進行合理分析。
表2 術后陰轉百分比評價
術前 | 術后 | 陰轉百分比 | |
檢測陽性 | a | b | （a-b）/a*100% |
術前術后采樣時間應結合疾病發展規律及治療后監測時間要求進行科學設定，建議收集患者手術后半年內的樣本進行檢測。此部分樣本量建議不少于40例。
4.臨床試驗質量控制
4.1方案設計的偏倚控制
不同的入組方式和入排標準會帶來入組人群的分布特征差異。為保證入組人群對篩查目標人群總體具有良好的代表性，臨床試驗方案應設置合理的入排標準，應分析目標人群的分布特征以及患病率等流行病學數據，以保證臨床試驗各人群占比結構合理性，避免帶來入組人群的選擇偏倚。
4.2 試驗實施質量控制
良好的結腸鏡檢查質量和息肉活檢率是準確的臨床診斷參考標準的有效保證。結腸鏡檢查質量應符合臨床公認的高質量檢查標準，即良好的腸道準備、盲腸插鏡以及退鏡時間至少6分鐘。結腸鏡息肉均應進行活檢。
應注意試劑檢測和結腸鏡檢查的時間間隔。試驗體外診斷試劑的樣本采集應在結腸鏡檢查之前完成，與結腸鏡檢查的時間間隔建議不超過12周，以降低偏倚風險，保障數據的可比性和結果的科學性。
5.倫理學要求
臨床試驗應當遵守《世界醫學大會赫爾辛基宣言》的倫理學準則，必須獲得倫理委員會的同意。研究者應充分考慮臨床試驗用樣本的獲得和試驗結果對受試者的風險性，應提交倫理委員會的審查意見。
6.臨床試驗方案、小結和報告
各臨床試驗機構應采用同一方案，并在整個臨床試驗過程中嚴格執行，不可隨意改動。方案中對試驗設計類型、對比方法選擇、受試者選擇、評價指標、統計分析方法、樣本量估算和質量控制要求等做出明確的規定，并根據各臨床試驗機構情況合理確定樣本量分配計劃。各臨床試驗機構選用的對比方法應保持一致，以便進行合理的統計學分析。
各臨床試驗機構應對臨床試驗數據和實施情況進行總結，出具臨床試驗小結。
臨床試驗報告應對整體臨床試驗實施過程、結果分析、試驗結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的數據和統計分析方法。
數據匯總表應詳細填寫患者的臨床背景信息，包括臨床診斷的確診依據、癌癥的分類分期等結果。
（二）產品說明書
產品說明書中【預期用途】項下建議描述為：
本產品用于體外定性檢測人XX樣本中XXX基因的甲基化。
本產品僅適用于臨床醫生建議進行結腸鏡檢查、因病人依從性差或其他醫學原因不適合接受結腸鏡檢查的患者。用于結直腸癌的輔助診斷，檢測結果僅供臨床參考。不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據。本產品檢測結果為陽性不是結直腸癌的確證證據，相關患者應轉診結腸鏡檢查；本產品檢測結果為陰性并不能保證沒有結直腸癌，如有必要，仍應建議患者繼續接受臨床診療規范中適用的其他診斷措施。臨床醫生應結合患者癥狀、體征、其他臨床診斷結果及個人結直腸癌相關風險因素等對患者病情進行綜合判斷。本產品不能替代腸鏡，不能替代病理學檢查。不能用于人群的腫瘤篩查。
本產品不推薦用于已確診結直腸息肉、結直腸癌或相關腸道疾病，如炎癥性腸病（IBD）、慢性潰瘍性結腸炎（CUC）、克羅恩病、家族性腺瘤性息肉病（FAP）病史的患者，及有CRC家族史等患者。
三、參考文獻
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[3]國家藥監局.體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則:國家藥監局關于發布體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則的通告(2021年第72號)[Z].
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[10]中國抗癌協會大腸癌專業委員會中國結直腸腫瘤早診篩查策略制訂專家組.中國結直腸腫瘤早診篩查策略專家共識.中華胃腸外科雜志,2018,21(10):1081-1086.
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